自2020年10月上?？祆`發(fā)布“非洲豬瘟高敏PCR試劑盒”（下稱(chēng)高敏試劑盒）以來(lái)，其出色的靈敏度、敏感性、特異性及穩定性迅速被廣大豬場(chǎng)實(shí)驗室認可。隨著(zhù)熒光PCR相關(guān)技術(shù)的普及以及用戶(hù)群體的增大，部分之前未被重視的問(wèn)題也逐漸顯露出來(lái)。本篇我們探討下各廠(chǎng)家都諱莫如深的一個(gè)點(diǎn)——“假陽(yáng)”問(wèn)題，以及相應的解決方案。

“假陽(yáng)”問(wèn)題，事實(shí)上在熒光PCR領(lǐng)域并不少見(jiàn)，而造成假陽(yáng)產(chǎn)生的原因也是紛繁復雜：如操作不當污染、環(huán)境氣溶膠污染或者試劑生產(chǎn)過(guò)程污染等。本文所要探討的“假陽(yáng)”，主要指因試劑特異性導致的假陽(yáng)，換句話(huà)說(shuō)，即文中所提的“假陽(yáng)”，與操作者、儀器、環(huán)境均無(wú)關(guān)，只與試劑盒內的試劑有關(guān)。那么試劑盒中到底什么與“假陽(yáng)”相關(guān)呢？縱觀(guān)商業(yè)化的非瘟病毒PCR檢測試劑盒，其中都會(huì )提及一個(gè)重要參數——特異性。

何為特異性呢？在PCR擴增過(guò)程中，如果我們要擴增的非洲豬瘟DNA片段在整條DNA鏈上不止出現了一次，或者樣品中混有的其他物種、細胞或病毒的DNA中含有類(lèi)似的DNA片段，則可能會(huì )將其他片段擴增出來(lái)，那最后儀器顯示出來(lái)的陽(yáng)性結果就不一定是非瘟病毒DNA造成的，于是陽(yáng)性結果也就變成了假陽(yáng)。因此，通俗來(lái)說(shuō)，特異性反應的是試劑盒能擴增出特定DNA片段的性能，特異性越低，則試劑盒擴增其他片段的概率就越大，即“假陽(yáng)”幾率更大。
   市售的眾多非瘟病毒PCR檢測試劑盒中，絕大多數廠(chǎng)商在宣傳其試劑盒特異性時(shí)均會(huì )標注＞99%，最低也不會(huì )低于98%，快靈的高敏試劑盒也是如此，特異性可達到99.9%，屬實(shí)是已經(jīng)做到了極限，即使PCR技術(shù)發(fā)展至今，因為模板DNA的不確定，依然無(wú)法保證100%的特異性。也正因此，特異性，也就是假陽(yáng)的問(wèn)題是被大家忽視了。

在服務(wù)客戶(hù)的過(guò)程中，我們發(fā)現很多客戶(hù)在進(jìn)行非瘟病毒檢測遇到極弱樣本或疑似樣本時(shí)，對于陽(yáng)性場(chǎng)，往往遵循的是“寧殺錯，不放過(guò)”，而對于陰性場(chǎng)，往往帶來(lái)心理的恐慌，需要確認到底是不是陽(yáng)性。的確，隨著(zhù)非瘟一波波的襲來(lái)，各檢測單位的工作量都史無(wú)前例的倍增，再重新來(lái)一遍的全面復核，顯然是對人力和成本的巨大考驗。面對這樣的大環(huán)境，快靈人陷入了沉思。

“我們?yōu)槭裁匆獙帤㈠e？”

“當真沒(méi)有辦法消除假陽(yáng)么？”

帶著(zhù)這樣的問(wèn)題，我們開(kāi)始了新的一輪又一輪的嘗試：提升試劑盒的靈敏度、將特異性由99%提升至99.9%……或許，我們可以把眼界放寬，不局限于單純的擴增？

于是，高敏試劑盒上市半年后，我們在高敏試劑盒基礎之上研發(fā)出其“升級版”——快靈高敏試劑盒（熔解確認版）。

快靈高敏試劑盒（熔解確認版），其性能參數與高敏試劑盒一致，我們同樣保證其靈敏度、敏感性、穩定性、特異性處在行業(yè)頂尖水平，確?？蛻?hù)可以第一時(shí)間檢測出陽(yáng)性樣本。包括其操作、擴增階段也與高敏試劑盒別無(wú)二致，至此，我們可以把快靈高敏試劑盒（熔解確認版）等同于高敏試劑盒。詳見(jiàn)表1：

表1：高敏試劑盒與假陽(yáng)確認試劑盒基本性能參數對比

但，重點(diǎn)來(lái)了！快靈是怎么做到的？快靈高敏試劑盒（熔解確認版）突破性地使用了一個(gè)新的反應程序——熔解曲線(xiàn)。熔解曲線(xiàn)能鑒別不同的DNA片段，依靠的不是Ct.值，而是其特有的熔解峰，即Tm值，即使一個(gè)DNA片段中僅相差一個(gè)堿基，都能導致Tm值變動(dòng)。依靠Tm值的判定就可以確認之前擴增陽(yáng)性的非瘟樣本是否為真的非瘟陽(yáng)性，以此達到鑒別假陽(yáng)，消除客戶(hù)疑慮的目的。

圖1：擴增曲線(xiàn)Ct.值判讀陰陽(yáng)        圖2：熔解曲線(xiàn)檢測疑似/弱陽(yáng)樣本，排除假陽(yáng)

非瘟新形勢下，除了要求試劑盒更早的檢測出陽(yáng)性，更需要真正“精準”檢測?？祆`高敏試劑盒（熔解確認版）除了超高的靈敏度、特異性，更是“自帶”熔解曲線(xiàn)，讓假陽(yáng)無(wú)處可藏，讓弱陽(yáng)“站得住腳”，真正做到打消客戶(hù)疑慮，真正做到“不殺錯、不放過(guò)”。